Nature子刊：转移性髓母细胞瘤通过重塑局部软脑膜微环境促进肿瘤细胞转移定植和生长

髓母细胞瘤（MB）是儿童最常见的恶性脑瘤，软脑膜转移是该病致死的主要原因。目前的治疗方法包括显微神经外科手术、大脑和脊髓的放射治疗以及细胞毒性化疗，尚未有生物或靶向疗法被批准用于治疗患有原发性或转移性 MB 的儿童。

MB 患者大多数因继发转移性肿瘤而死亡。临床治疗中通常选择对整个颅脊髓轴进行放射治疗，但代价是损害发育中的神经系统 。MB 几乎只转移至软脑膜，这种精准选择背后的机制尚未可知。在对原代肿瘤细胞和转移性肿瘤细胞的转录水平上的比较研究发现存在差异，意味着不同的肿瘤微环境中存在着不同的生物活性和转录状态。

近日，由 Namal Abeysundara 和 Alexandra Rasnitsyn 团队发表在 Nature Cell Biology上题为 Metastatic medulloblastoma remodels the local leptomeningeal microenvironment to promote further metastatic colonization and growth 的文章，研究者利用单细胞测序等方法，揭示了肿瘤细胞转移受到微环境影响的调控机制，提出通过靶向PDGF-BMP信号轴干预转移微环境的治疗策略，为临床开发新疗法提供思路。

软脑膜的生存环境为营养较为贫乏的脑脊液，与具有丰富血管营养的大脑和脊髓环境形成鲜明对比。基于此背景，研究者假设肿瘤细胞能够形成软脑膜转移瘤必须先建立一个支持性的微环境定植在软脑膜，然后才能进行增殖扩大形成转移瘤。因此研究者使用基因工程技术建立了软脑膜转移的MB模型小鼠，并沿脊髓长轴显微分离出荷瘤小鼠的脊髓软脑膜，对分离出的荷瘤小鼠的脊髓软脑膜及其原发性肿瘤、非荷瘤小鼠的软脑膜进行scRNA-seq分析。在比较原发性肿瘤及其肿瘤微环境的 65,086 个单细胞与转移性脊髓软脑膜的 76,477 个单细胞（LPT-MET），发现 LPT-MET 样本中来自肿瘤微环境（ TME ）的细胞比例高于原发性肿瘤样本。同时，在对原代肿瘤细胞与转移性肿瘤细胞之间的细胞转录水平分析发现，细胞的有氧代谢和核酸合成发生变化。

对细胞间信号传导的研究发现，原发性肿瘤细胞间信号传导最活跃发生在肿瘤细胞间，而在转移性软脑膜肿瘤中，最活跃的信号传导发生在肿瘤细胞和肿瘤微环境的不同细胞类型之间。研究者假设转移性肿瘤细胞和 TME 的各种细胞成分之间的细胞间信号传导可能促进软脑膜的定植和转移性 MB 的后续生长。

基于上述假设，研究者比较了健康、非荷瘤软脑膜 （LPT-WT） 和转移软脑膜肿瘤 （LPT-MET）中的细胞类型。分析LPT-WT 的 39,860 个细胞和 LPT-MET 的 76,477 个细胞的单细胞转录水平数据，发现存在着不同的细胞类型，其中微环境中的八个细胞类型均与肿瘤细胞相互作用，也证实了转移软脑膜肿瘤存在着一个复杂的微环境系统，其中脑膜成纤维细胞与转移性肿瘤细胞和 TME 的细胞间的通讯最强。

图1.MB 原发性和转移性肿瘤细胞功能的不同；a Ptch-SB 原发性肿瘤和转移性肿瘤模型小鼠脊髓软脑膜和小鼠非肿瘤脊髓软脑膜；b 原发性肿瘤细胞和转移性脊髓软脑膜细胞（LPT-MET）UMAP图；c、d 转移性脊髓软脑膜组（LPT-MET）细胞种群UMAP图；e 不同细胞群中表达前五的Marker；f 原代和 LPT-MET 肿瘤细胞中差异表达的基因

通过使用GFP标记的转移性肿瘤细胞，研究者发现转移性肿瘤细胞与软脑膜血管有着密切关系，其主要位于富含细胞外基质的微环境中，并围绕血管网络分布。

随后，研究者对转移性肿瘤细胞影响脑膜成纤维细胞的潜在分子机制开展相关研究。过程中发现转移性软脑膜含有更多的 PDGFR-α阳性脑膜成纤维细胞，当 PDGFA 过表达时，肿瘤细胞增殖能力提升，小鼠的总存活率降低。研究者认为分泌 PDGFA 的肿瘤细胞扩散到局部微环境中，可以将额外的脑膜成纤维细胞募集到转移生态位上，促进肿瘤细胞的增殖。

图2. 转移性软脑膜中独特的微环境信号

为此，研究者对转移性脑膜成纤维细胞的转录程序开展了相关的分析研究。研究者在对比健康脑膜成纤维细胞的转录方式发现，LPT-MET成纤维细胞与其具有明显的差异，特异性的转录程序包括TGFβ、BMP、WNT和ERK1/2 通路，差异性表达与 ECM 组织、白细胞迁移、血管生成、细胞死亡、分化和增殖相关的基因。对LPT-MET成纤维细胞亚群进行分析，确定7个独特的成纤维细胞群，编号为LMF1~LMF7。其中LMF1细胞群是主要的成纤维细胞群，它与ECM的重塑基因有关，并且具有与ECM组织、伤口愈合、细胞粘附和增殖相关的转录程序，其转录通路与确定的转移相关通路相似。对比已知的癌症相关成纤维细胞（CAF），LMF1细胞群具有肌成纤维细胞和一般成纤维细胞的特征，前者表达Col1a1, Col4a1, Tgfb1基因，后者表达Pdgfra和 Pdgfrb基因。而LMF7细胞群更类似于具有炎症或抗原呈递功能的CAFs。这个发现支持了转移性肿瘤细胞存在募集和重编程脑膜成纤维细胞的假设。

图3 脑膜成纤维细胞在肿瘤细胞存在下被募集、增殖

随着癌症进程的发展，CAF会随之与肿瘤细胞共同进化。研究者对比了低转移负荷与较高转移负荷的 LPT-MET 样本之间的脑膜成纤维细胞发现，高度转移样本中的LMF1 和 LMF5 细胞群呈增加的趋势，类似于肌成纤维CAF，而低转移性的成纤维细胞在转录上更类似于炎性CAF。这种在转录程序间的差异意味着纤维细胞随着转移性肿瘤细胞的积累在肿瘤微环境中逐渐募集和重编程。在对其分子机制研究发现，BMP信号在LPT-MET成纤维细胞中大量表达，低转移负荷的脑膜成纤维细胞表达 Bmp4、Bmp5 和 Bmp7 以向转移性肿瘤细胞和局部星形胶质细胞、室管膜、平滑肌细胞和周细胞发出信号，随着病程发展至高转移程度时，脑膜成纤维细胞表达 Bmp4 和 Bmp7 作用于肿瘤细胞，BMP靶基因ID1高表达。

图4.转移性肿瘤微环境中脑膜成纤维细胞异质性

研究者将过表达BMPR1A (Q233D)的D458 MB肿瘤细胞（协同表达GFP和ZsGreen ）和空载体对照细胞共同植入免疫功能低下的NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/Sz）侧脑室中。发现植入 BMPR1A-CA 表达细胞的小鼠的肿瘤负荷增加，表现出软脑膜定植增强。

基于上述发现研究者提出了干扰转移性肿瘤细胞和脑膜成纤维细胞之间的募集、重编程和/或细胞间信号传导可以预防转移性或治疗已转移MB的策略。

为此研究者将3组MB患者来源的异种移植物与表达GFP和ZsGreen（GFP-Luc）的MB411细胞进行了NSG小鼠体内共植入研究。结果发现与单独植入 MB411 细胞的小鼠相比，共同植入 MB411 +转移性软脑膜中分离的PDGFRα 阳性成纤维细胞（MB-MAF）的小鼠沿颅脊髓轴的生物发光信号更高，肿瘤负荷增加，总生存率更差。接着，研究者将D458 Luc-ZsGreen 肿瘤细胞植入NSG小鼠的侧脑室，植入后10天将 IgG 对照和抗 PDGFRα 中和抗体注入小鼠的侧脑室。结果发现抗 PDGFRα治疗后的小鼠比用 IgG对照处理的小鼠生存期延长。

图5. 表达BMP 信号的转移性肿瘤细胞细胞周期、表现出软脑膜定植增强

综上，本研究揭示软脑膜转移的微环境调控网络，提出软脑膜成纤维细胞在转移存在的情况下通过PDGFA分泌被募集。软脑膜成纤维细胞被募集后增殖、重编程为 MB-MAF，随后分泌 BMP4/7，驱动肿瘤细胞分裂并增强软脑膜定植，MB-MAF 分泌作用于 LPT-MET 细胞的 BMP 并诱导 LPT-MET 增殖以进一步产生和分泌额外的促肿瘤信号。治疗方案可根据转移性肿瘤微环境需要多重级联反应的分子信号通路或特定的 TME 细胞类型制定不同的策略，对软脑膜转移性微环境调控网络研究将为开发通过微环境调控预防或治疗转移性 MB 的疗法提供机会。